Aplicando modelagem e dinâmica no estudo da enzima IDUA

Recentemente foi publicado o fruto de uma colaboração entre o NBLI e o Centro de Terapia Gênica do HCPA, focado na modelagem da enzima humana α-L-iduronidase (IDUA). Este é o tema do post de hoje do Blog da Sociedade Brasileira de Imunologia (SBlogI), confira!

O artigo "Lessons from molecular modeling human α-l-iduronidase", publicado no Journal of Molecular Graphics and Modelling (2014), pode ser conferido gratuitamente utilizando-se este link (válido apenas até o dia 19/12/2014) ou diretamente através do site da revista (acesso restrito).

Confira também a nossa página no Facebook.

Imunogenética + Bioinformática = Imunoinformática

O post de hoje do Blog da Sociedade Brasileira de Imunologia (SBlogI) realiza uma breve revisão sobre o contexto histórico do surgimento da "Imunoinformática", com enfoque para a criação do IMGT (the international ImMunoGeneTics information system). Através da pesquisa de termos no banco Pubmed, o post também salienta a crescente utilização de ferramentas computacionais no campo do desenvolvimento de vacinas.

Siga o link abaixo e confira o texto na íntegra:

Genética e Bioinformática se encontram nas fronteiras da Imunologia.

A história do NBLI em três capítulos

Foi publicado hoje no Blog da Sociedade Brasileira de Imunologia (SBlogI) a terceira parte post contando a história das pesquisas desenvolvidas pelo NBLI, no campo da imunologia molecular in silico. A linha de pesquisa que originou o grupo se iniciou com o Projeto de Mestrado de Gustavo Fioravanti Vieira, desenvolvido dentro do Laboratório de Imunogenética da UFRGS, sob orientação do Professor José Artur Bogo Chies. 

O trabalho que inicialmente envolvia a análise de sequências virais, evoluiu rapidamente para também incluir ferramentas de bioinformática estrutural, em especial o docking e a dinâmica molecular. Embora as ferramentas utilizadas tenham se diversificado ao longo dos anos, o interesse nos mecanismos da reatividade cruzada e no planejamento de novas vacinas antivirais sempre norteou as pesquisas do grupo, desde a publicação da primeira hipótese em 2005 (Vieira e cols., 2005), até a recente publicação do banco de dados CrossTope (Sinigaglia e cols., 2013).

Confira nos links abaixo os três capítulos desta história:
Parte I:    Buscando padrões em sequências virais;
Parte II:   A Imunoinformática Estrutural;
Parte III:  Clusterização Hierárquica e Reatividade Cruzada;

Revelando o efeito de mutações no Fator VIII da coagulação

    A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, causada pela atividade reduzida ou ausente do fator VIII da coagulação (FVIII). Essa doença é o resultado de diferentes mutações no gene do FVIII. A identificação das mutações patogênicas é importante para o aconselhamento genético e para a avaliação e tratamento das manifestações clínicas. Embora inúmeras mutações no gene já tenham sido descritas como responsáveis pela HA grave (nível de FVIII <1%), moderada (nível de FVIII entre 1% e 5%) e leve (nível de FVIII entre 5% e 50%), não existiam dados a respeito na população do Rio Grande do Sul.

    Em um recente estudo coordenado pelos Professores Francisco Mauro Salzano e Eliane Bandinelli (Departamento de Genética, UFRGS) foram identificadas alterações genéticas em 36 pacientes hemofílicos graves, 21 pacientes hemofílicos moderados e 55 pacientes com hemofilia leve, todos de diferentes famílias. Todos os hemofílicos graves apresentaram resultado negativo para a presença das inversões nos íntrons 22 e 1, mutações mais comumente encontradas (40-50% e 5%, respectivamente) em hemofílicos A graves. Todos os pacientes foram analisados por sequenciamento direto dos éxons. As variações nas sequências foram verificadas com os softwares Codon Code Aligner e MEGA5.04, para realizar alinhamentos múltiplos e para analisar a sequência de aminoácidos da proteína mutante. O software PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping [1]) foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estrutura e a função da proteína; o software SDM (Site Direct Mutator [2]) foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estabilidade da proteína. O software HOPE (Have yOur Protein Explained [3]) também foi uma ferramenta utilizada para prever o efeito das mutações na estrutura da proteína.

    O Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI) contribuiu neste estudo com a localização das mutações na proteína codificada pelo gene do FVIII. Foi utilizado o programa Pymol para a visualização da estrutura da proteína e o programa GRASP2 para a representação do potencial eletrostático na superfície.

Figura 1. Mutações de sentido trocado encontradas nos pacientes hemofílicos graves do Rio Grande do Sul. As mutações coloridas em vermelho são mutações novas e aquelas coloridas em azul são mutações previamente descritas. Esferas amarelas representam íons cálcio e esferas roxas representam íons cobre. A mutação D542G está localizada em um segundo sítio de baixa afinidade com o íon cálcio, o que pode contribuir na afinidade entre domínios, na interface entre os domínios A2 e A3. A mutação S109P, descrita pela primeira vez neste trabalho, está localizada no domínio A1, nos resíduos 108-124, o qual pode conter um sítio de Ca2+.
Modificado de Gorziza et al. 2013.

Figura 2. O efeito da mutação L2297R sobre o potencial eletrostático do FVIII. Na esquerda, está representada a molécula do FVIII, com seu domínio C2 em vermelho. Na direita, acima, está a proteína selvagem L2297 e abaixo, os resíduos mutados estão representados. Note que na estrutura mutada há uma área pronunciada de cargas carregadas positivamente, ausente na estrutura selvagem. Azul, positivo; vermelho, negativo; branco, cargas neutras. Os valores das cargas calculadas variam entre -5 kT (vermelho) e +5 kT (azul). Modificado de Gorziza et al., 2013.

   
    Foram encontradas nos pacientes graves: uma grande deleção, nove pequenas deleções, cinco pequenas inserções, oito mutações de sentido trocado e seis mutações sem sentido, das quais treze são recorrentes e dezesseis são novas mutações, não descritas no banco de dados online HAMSTeRS [4]. Entre outras mutações de efeito evidente, foram encontradas duas mutações (D542G e S109P) que podem interferir em sítios de ligação ao cálcio, uma mutação (P2205R) que pode ser prejudicial à interação entre o FVIII e o fator de von Willebrand (FvW) e uma mutação (L2297R), que altera a superfície eletrostática da proteína. Todas essas interações são fundamentais para que a proteína do FVIII tenha atividade normal. As Figuras 1 e 2 ilustram essas mutações.

Nos pacientes leves, foram encontradas 27 mutações de sentido trocado, uma pequena deleção, duas pequenas duplicações e três mutações em sítios de processamento de RNA, sendo que nove dessas mutações não eram descritas em outras populações no banco de dados HAMSTeRS. As ferramentas de bioinformática tiveram grande importância para ilustrar o possível efeito dessas mutações na proteína. Todas as mutações de sentido trocado estão representadas na Figura 3, que mostra a posição e a diferença entre os resíduos mutantes e selvagens da proteína. 

 Figura 3. Localização das novas mutações de sentido trocado na proteína FVIII. Mutações ilustradas em vermelho ocorrem em pacientes moderados e as ilustradas em verde em pacientes leves.  A cadeia lateral dos aminoácidos selvagens está ampliada e as dos resíduos mutantes esta representada ao lado ou abaixo. Esferas amarelas representam íons cálcio e esferas vermelhas íons cobre. Modificado de Rosset et al., 2013.

    A mutação p.Val266Met, está próxima a um sítio de ligação ao cobre, fundamental para a estabilidade da proteína. Essa mutação foi predita pelos softwares preditores do efeito de mutações causadoras de doença. Outra mutação provavelmente causadora de doença encontrada foi a p.Gly304Val, localizada próxima a um sítio de ligação ao fator X, fundamental para a atividade de coagulação (Figura 3). A mutação p.Met567Lys provoca uma mudança de carga nessa posição, podendo causar repulsão entre os resíduos vizinhos, como mostra a Figura 4. 

Figura 4. Na esquerda, está representada a molécula do FVIII ativada, com seu domínio A2 em vermelho. Na direita, acima, a representação da superfície eletrostática do domínio com o aminoácido Met567, selvagem. Abaixo a representação da superfície eletrostática do domínio com o resíduo mutante, Lys567. Próximo ao resíduo mutado há uma grande área com cargas positivas, ausente na estrutura selvagem. Azul, positivo; vermelho, negativo; branco, cargas neutras. Os valores das cargas variam entre -10 kT e +10 kT. Modificado de Rosset et al., 2013.

    Todos esses dados contribuem para o melhor entendimento da funcionalidade e da estrutura do FVIII. A visualização das alterações na proteína esclarece a relação genótipo/fenótipo, explicando a provável causa da doença nos pacientes estudados. Para uma leitura mais completa dos resultados e a visualização das figuras em maior resolução, acesse os trabalhos originais: Gorziza et al., 2013 e Rosset et al., 2013.

Texto de Roberta Petry Gorziza e Clévia Rosset.

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Editado por Dinler Amaral Antunes.

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Referências:
1. Adzhubei IA, Schimidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods 2010; 7: 248-9.
2. Worth CL, Preissner R, Blundell TL. SDM – a server for predicting effects of mutations on protein stability and malfunction. Nucl Ac Res 2011; 39: 215-232.
3. Venselaar H, Te Beek TA, Kuipers RK, Hekkelman ML, Vriend G. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases. An e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics 2010; 11:548.
4. The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS). Available at: http://europium.csc.mrc.ac.uk/Web- Pages/Main/main.htm (last accessed on 10 January 2013).

Professores da UFRGS recebem a medalha Simões Lopes Neto

Na tarde de ontem (21/03/2014), o governador Tarso Genro entregou aos professores eméritos da UFRGS Francisco Mauro Salzano e Jorge Almeida Guimarães a medalha Simões Lopes Neto. Esta honraria é outorgada pelo Estado do Rio Grande do Sul a personalidades das artes, das letras, das ciências, da educação e outras áreas.

Confira a reportagem completa no site da Universidade.

VII Simpósio Sul de Imunologia

Estão abertas as inscrições para o VII Simpósio Sul de Imunologia, a realizar-se na PUCRS entre os dias 03 e 05 de abril de 2014.

Maiores informações no site do evento.

Predizendo resistência do HIV ao Nelfinavir

Em uma recente publicação na revista PLOS ONE, o NBLI apresenta os resultados de uma colaboração estabelecida com pesquisadores do Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT/FEPPS). A protease do HIV-1, cuja a estrutura é representada na imagem ao lado, é uma enzima fundamental para o ciclo de replicação do vírus. Este é um importante alvo da terapia antiretroviral, sendo o Nelfinavir um dos medicamentos mais utilizados para a inibição desta enzima. A protease do HIV-1 apresenta duas regiões flexíveis, referidas como flaps (região representada em vermelho na figura acima), as quais se abrem permitindo a entrada do substrato. Os inibidores de protease se posicionam no centro da estrutura da enzima, ocupando seu sítio catalítico e mantendo a enzima nesta conformação fechada. No entanto, o frequente surgimento de mutações nas sequências virais confere resistência aos fármacos inibidores da protease.

Em um trabalho prévio, a equipe do CDCT identificou mutações incomuns nas sequências de protease obtidas de pacientes gaúchos infectados com o vírus HIV (de Medeiros e cols., 2011). Outras mutações mais comuns, nestas mesmas posições (30/129 e 32/131), já haviam sido descritas como sendo responsáveis pela resistência ao Nelfinavir (D30N) e a múltiplos fármacos (V32I). A questão que precisava ser respondida agora era se estas mutações "novas" (D30V e V32E), encontradas em pacientes HIV+ que ainda não estavam sendo tratados, também conferiam resistência ao Nelfinavir. Esta resposta não é fácil de se obter em laboratório, pois exige expressar e purificar in vitro a proteína do vírus mutante. Este procedimento é muito mais difícil e caro do que a simples identificação da presença das mutações, que é realizada pela análise do DNA viral presente em uma amostra de sangue do paciente.

Neste novo trabalho, o grupo do NBLI modelou e analisou a estrutura de proteases contendo as mutações descritas pela equipe do CDCT, analisando o impacto destas mutações sobre a interação com o fármaco Nelfinavir (Antunes e cols., 2014). Este estudo foi realizado completamente in silico (no computador), através de ferramentas gratuitas e utilizando como entrada as sequências virais obtidas pela equipe do CDCT. Uma vez padronizados, os procedimentos utilizados neste estudo poderiam agora ser aplicados de maneira rápida e barata para quaisquer novas mutações que forem identificadas.

A protease selvagem do subtipo B (representada em preto na figura acima), que é suscetível ao efeito do Nelfinavir, permaneceu na conformação fechada em todas as simulações realizadas. Por outro lado, ambas as mutações estudadas (D30V e V32E) induziram modificações importantes no comportamento dinâmico da enzima na presença do fármaco, efeito que de acordo com os controles utilizados é indicativo de resistência ao Nelfinavir. A mutação V32E parece ter um efeito mais dramático na dinâmica dos flaps da enzima, induzindo a troca para uma conformação aberta da protease em dois dos subtipos do vírus. Imagens da conformação do complexo Protease-Nelfinavir em diferentes momentos da simulação são apresentadas na figura abaixo. Compare as conformações observadas para as mutantes do subtipo B (em azul) e do subtipo C (em verde), com aquelas apresentadas pelo tipo selvagem do subtipo B (em preto).

A mutação D30V apresentou um comportamento mais sutil, o qual foi variável dependendo do subtipo viral. No subtipo B, ela induziu uma alteração para um estado semi-aberto da protease (em verde na figura ao lado). Este estado é equivalente aquele induzido pela mutação D30N (em vermelho), cujo efeito de resistência ao Nelfinavir já foi confirmado experimentalmente (Santos e cols. 2011). Os estados fechado e semi-aberto são diferenciados pela medida da distância entre os resíduos 25 e 50 da cadeia A da protease (linha tracejada na primeira figura do texto), sendo 1,58 nanômetros (nm) o ponto de corte para determinar a conformação semi-aberta (figura ao lado).

O trabalho também avaliou as diferentes conformações adotadas pelo fármaco na presença de cada uma das proteases estudadas, descrevendo como estas mutações interferiam na rede de ligações de hidrogênio responsável pela estabilidade do complexo Protease-Nelfinavir.

Os resultados descritos acima podem ser visualizados de forma dinâmica em vídeos que foram incluídos no material suplementar do artigo. Confira um deles abaixo:

O PDF com o trabalho pode ser baixado no site da revista PLOS ONE.